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實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行無乳鏈球菌血清分型的實(shí)驗(yàn)步驟

 更新時(shí)間:2022-09-23 點(diǎn)擊量:1782
實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行無乳鏈球菌血清分型的實(shí)驗(yàn)步驟
B組鏈球菌(GBS) 是一種熒光檢測(cè)帶有包膜的革蘭氏陽(yáng)性菌,是新生兒侵襲性感染敗血癥和腦膜炎的重要原因,GBS血清抗體傳統(tǒng)分型法通常需要經(jīng)過乳膠凝集、多重 PCR 和條帶大小分析或全基因組序列分析等步驟,過程繁瑣,技術(shù)成本昂貴,所以在PCR實(shí)驗(yàn)室中采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法進(jìn)行血清分型不僅可以替代乳膠凝集法,還可以改進(jìn) GBS 血清型數(shù)據(jù)的采集。



GBS 細(xì)菌菌株分離與培養(yǎng)
將GBS 分離株在胰蛋白酶大豆 (TS) 或 5% 羊血瓊脂平板上于37°C 培養(yǎng),然后在 TS 培養(yǎng)基中于 37°C 培養(yǎng)過夜。

通過乳膠凝集進(jìn)行血清分型
根據(jù)制造商的說明,使用 Immulex Latex Agglutination Streptococcus B 試劑盒(Staten Serum Institute;Copenhagen,Denmark)通過乳膠凝集對(duì)所有 GBS 分離株進(jìn)行血清分型。簡(jiǎn)而言之,將 10 μl 乳膠試劑添加到懸浮在 10 μl 鹽水中的單個(gè) GBS 菌落中。如果 30 秒后可見凝集,則旋轉(zhuǎn)反應(yīng)并解釋為陽(yáng)性。 

實(shí)時(shí)熒光定量法 PCR 進(jìn)行血清分型
設(shè)計(jì)引物和探針以擴(kuò)增無乳鏈球菌每種血清型的多糖莢膜基因的區(qū)別區(qū)域。引物中的寡核苷酸未經(jīng)修飾和脫鹽,探針用熒光探針(5' 6-羧基熒光素 (6-FAM))和兩種猝滅劑標(biāo)記,并通過高壓液相色譜法純化.

PCR實(shí)時(shí)熒光定量分析
使用 Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit 從 GBS 的過夜培養(yǎng)物中提取基因組 DNA。PCR 反應(yīng)最終體積為 20 μl,由 10 μl Taqman Universal Mastermix、7.4 μl 無菌水、0.2 μl 正向引物(100 μM 原液)、0.2 μl 反向引物(100 μM 原液)、0.2 μl 探針(100 μM 儲(chǔ)備液)和 2 μl GBS DNA(25 ng/μl)。在 熒光定量PCR儀器上進(jìn)行三次反應(yīng),并進(jìn)行軟件分析。反應(yīng)參數(shù)如下: 50°C 初始孵育 2 分鐘;在 95 °C 下初始變性 10 分鐘;在 95 °C 15 秒和 60 °C 1 分鐘下進(jìn)行 35 個(gè) PCR 循環(huán)。陽(yáng)性反應(yīng)定義為循環(huán)閾值(CT ) < 30 對(duì)于 50 ng DNA 模板/反應(yīng)。每次運(yùn)行都包含陰性對(duì)照反應(yīng)(無 DNA 模板)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與乳膠凝集進(jìn)行比較。通過對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 方案檢測(cè)到預(yù)測(cè)序列,并且與任何其他血清型引物/探針組合沒有陽(yáng)性反應(yīng)。而后通過乳膠凝法集確認(rèn)了 47 株菌株的血清型,由此驗(yàn)證基于 PCR 的方法和乳膠凝集方法的血清分型結(jié)果無差異。
 
型號(hào)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR法乳膠凝集法
AR611
AR618
AR624
AR626
AR629
AR630ⅠbⅠb
AR631
AR634
AR667
AR880
AR905ⅠaⅠa
AR1019ⅠaⅠa
AR1021
AR1036ⅠaⅠa
AR1037
AR1046
AR1049ⅠaⅠa
AR1053ⅠaⅠa
AR1054
AR1055
AR1056
通過實(shí)時(shí) PCR 和乳膠凝集對(duì) 21 種未知血清型的分離株進(jìn)行了檢測(cè)。通過實(shí)時(shí) PCR,所有菌株都給出了單一的血清型(C T ?< 30;50 ng 模板/反應(yīng)的范圍為 15-23)。
 
實(shí)驗(yàn)方法對(duì)比
我們知道用于 GBS 血清分型技術(shù)的基于非核酸的實(shí)驗(yàn)室方法成本較高,并且需要高滴度的血清型特異性抗血清,并且會(huì)阻礙 GBS 血清型流行率的研究。而乳膠凝集試劑盒可若用于實(shí)驗(yàn)室的 GBS 血清分型,其價(jià)格也較貴。通過分子莢膜分型技術(shù),包括多重 PCR   全基因組序列的靶向分析新可用的序列信息的適應(yīng)性和相對(duì)容易的性能,但僅能分血清型 Ia、Ib 和 III 三種血清型。

   與許多現(xiàn)有方法不同,實(shí)時(shí) PCR 法的血清分型不是基于操作員對(duì)生化反應(yīng)的解釋,它允許特異性鑒定 GBS 血清型,盡管會(huì)受到其他細(xì)菌 DNA 的干擾,但它可能在流行病學(xué)研究的背景下比較有用,作為現(xiàn)有多重 PCR 檢測(cè)的替代方法。隨著進(jìn)一步的發(fā)展,這種新方法可以直接從標(biāo)本中檢測(cè) GBS 血清型,而無需培養(yǎng)。這種方法基于實(shí)時(shí) PCR 的血清分型雖然便捷,但檢測(cè)由于需要特定的引物-探針組所以暫時(shí)無法直接識(shí)別新的血清型。


來源:蘇州阿爾法生物實(shí)驗(yàn)器材有限公司


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