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質(zhì)粒DNA的提取實驗方法和步驟

 更新時間:2023-02-14 點擊量:2157

質(zhì)粒DNA的提取實驗方法和步驟

一、實驗目的
通過本實驗學習和掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的原理和步驟。
二、實驗原理
從細菌中分離質(zhì)粒DNA 的方法都包括3個基本步驟:培養(yǎng)細菌使質(zhì)粒擴增;收集和裂解細胞:分離和純化質(zhì)粒DNA。采用溶菌酶可以破壞菌體細胞壁,十二烷基磺酸鈉(SDS)和Triton X-100 可使細胞膜裂解。經(jīng)溶菌酶和SDS 或Triton X-100 處理后,細菌染色體DNA 會纏繞附著在細胞碎片上,同時由于細菌染色體DNA 比質(zhì)粒大得多,易受機械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。
堿裂解法提取質(zhì)粒是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA在拓撲學上的差異來分離它們。在pH值介于12.0~12.5這個狹窄的范圍內(nèi),線性的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性,盡管在這樣的條件下,共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵會被斷裂,但兩條互補鏈彼此相互纏繞,仍會緊密地結(jié)合在一起。當加入pH4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復pH至中性時,共價閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起,因此復性迅速而準確,而線性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已分開,復性就不會那木迅速而準確,它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),通過離心,染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA,蛋白質(zhì)-SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。
質(zhì)粒DNA小量提取法對于從大量轉(zhuǎn)化子中制備少量部分純化的質(zhì)粒DNA十分有用。這些方法共同特點是簡便、快速,能同時處理大量試樣,所得DNA有一定純度,可滿足限制酶切割、電泳分析的需要。
三、主要試劑
1. 溶液Ⅰ:50 mmol/L葡萄糖,25mmol/LTris (pH 8.0) ,10 mmol/L EDTA(pH 8.0)
2. 溶液Ⅱ:0.2 mol/L NaOH,1% SDS(新鮮配制)
3. 溶液Ⅲ:5 mol/L乙酸鉀 60 mL,冰乙酸11.5 mL,水28.5 mL
4. 70%乙醇
5. 氯仿: 按氯仿:異戊醇=24:1 體積比加入異戊醇。氯仿可使蛋白變性并有助于液相與有機相的分開,異戊醇則可起消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫。氯仿均有很強的腐蝕性。
6. RNaseA:將RNA酶溶于10 mmol/L Tris. (pH7.5)、15 mmol/L NaCl中,配成10 mg/mL的濃度,于100℃加熱15min,緩慢冷卻至室溫,保存于-20℃。
7. LB+Amp100培養(yǎng)基:LB液體培養(yǎng)基內(nèi)加入100ug/mL的氨芐青霉素。注意Amp遇高溫分解,待培養(yǎng)基溫度低于60℃時加入。
四、儀器耗材
恒溫搖床、冷凍離心機、移液槍一套、制冰機、三角瓶、Eppendorf管、試管、培養(yǎng)皿、試劑瓶、超凈工作臺。
五、實驗步驟
1. 從平板上挑取單克隆,加入含有3mL LB+Amp100的試管中,37℃振蕩培養(yǎng)過夜。
2. 取培養(yǎng)物倒入1.5 mL微量離心管中,4000 r/min 離心2 min。
注:剩余培養(yǎng)物放置4℃,用于保菌。
3. 倒出培養(yǎng)液,使細胞沉淀盡可能干燥。
4. 將細菌沉淀懸浮于100 μL溶液Ⅰ中,充分振蕩混勻,室溫放置5 min。
5. 加200 μL溶液 Ⅱ(新鮮配制),蓋緊管口,顛倒混勻內(nèi)容物,將離心管放冰上5 min 。
6. 加入150 μL溶液 Ⅲ(冰上預冷),蓋緊管口,顛倒數(shù)次使混勻。冰上放置5 min。
7. 12000 r/min ,離心15 min ,將上清轉(zhuǎn)至另一離心管中。350μL
8. 向上清中加入等體積氯仿/異戊醇(24:1)(去蛋白),反復混勻,10000 r/min,離心10 min,將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。該步驟可以不做。
9. 向上清加入2倍體積乙醇700μL,混勻后,室溫放置15-30min。10000r/min離心10 min。倒去上清液,把離心管倒扣在吸水紙上,吸干液體。
10. 用500 μL 70% 乙醇輕輕洗滌質(zhì)粒DNA沉淀,離心10000r/min離心5min棄上清,干燥。
11. 加入適量(20-50 μL)的無菌水,室溫使DNA溶解,-20℃保存。
六、注意事項
1. 溶液II需要新鮮配制。
2. 加入溶液II后不能劇烈震蕩。
3. 沉淀DNA 通常使用冰乙醇,在低溫條件下放置時間稍長可使DNA 沉淀。沉淀DNA 也可用異丙醇(一般使用等體積),且沉淀,速度快,但常把鹽沉淀下來,所以多數(shù)還是用乙醇。
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