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原生質(zhì)體葉肉細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)步驟

 更新時(shí)間:2023-05-18 點(diǎn)擊量:1156

原生質(zhì)體葉肉細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)步驟
1、生長(zhǎng)培養(yǎng)好的試驗(yàn)材料(一般為生長(zhǎng)20天左右的擬南芥幼苗葉片)
2、在擬南芥開花前取樣(30片葉子左右即可)
3、切取葉片為0.5-1mm的細(xì)條(如果材料能達(dá)到每克107個(gè)原生質(zhì)體,10-20片葉子需要5-10mL酶解液)
4、迅速將切下的樣品轉(zhuǎn)到酶解液中,要求浸沒。
5、黑暗條件下抽真空30min。
6、連續(xù)酶解,室溫下23℃黑暗中靜止酶解3h
7、利用光學(xué)顯微鏡檢查原生質(zhì)體(30-50μm大?。?/span>
8、在過濾前加入等量的W5溶液
9、洗干凈濾網(wǎng),并用W5潤(rùn)濕,之后過濾
10、離心100g,1-2min沉淀原生質(zhì)體,盡可能吸走上清,重復(fù)洗2次
11、重懸原生質(zhì)體于W5中,保持在2*105個(gè)/ml,冰浴30min。
12、100g離心2min,盡可能吸走上清,利用MMG重懸,濃度約2*105個(gè)/ml
13、加入10μL質(zhì)粒(1000ng-2000ng)于2ml離心管中
14、加入100μL原生質(zhì)體(2*104個(gè)),輕輕混勻。
15、加110μL PEG solution,輕彈使充分混勻
16、23℃室溫孵育30min。
17、加400-440μL W5混勻,終止反應(yīng)
18、100g,2min 23℃離心,去上清,重復(fù)洗一次
19、用1mL W5重懸原生質(zhì)體并放入6孔板中培養(yǎng)
20、20-25℃孵育16h以上
21、取樣制片觀察
 
溶液配制:
1、酶解液的配制(20ml)試劑終濃度質(zhì)量/g

試劑終濃度質(zhì)量/g
MES20mM0.08528KOH調(diào)pH5.7
D-Mannitol0.4M1.45736
KCl20mM0.02982
macerozyme R-100.40%0.08
Cellulase R-101.50%0.3
55℃水浴10min,待冷卻后再加以下試劑
CaCl2·2H2O10mM0.029402
BSA0.10%0.02

W5溶液配制(500mL)

試劑終濃度質(zhì)量/g
MES2mM0.19524KOH調(diào)pH5.7
NaCl154mM4.49988
CaCl2·2H2O125mM9.18825
KCl5mM0.186375

MMG配制(100mL)

試劑終濃度質(zhì)量/g
MES4mM0.078096KOH調(diào)pH5.7
D-Mannitol0.4M7.2868
MgCl2·6H2O15mM0.30495

PEG配制(10mL)

試劑終濃度質(zhì)量/g
PEG 400040%4
D-Mannitol0.2M0.36434
CaCl2·2H2O100mM0.14701


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